Meccanismi molecolari degli effetti anti-aterogeni degli acidi grassi Omega-3

Meccanismi molecolari degli effetti anti-aterogeni degli acidi grassi Omega-3
Raffaele De Caterina
Cattedra di Cadiologia, Università Degli Studi “G. D’annunzio” – Chieti

ACIDI GRASSI OMEGA-3 E STABILITA’ DI PLACCA

Gli acidi grassi omega-3 non hanno solo effetti antiaritmici e di prevenzione della morte improvvisa, peraltro oramai ben noti ed ampiamente discussi nella comunità cardiologica², ma posseggono anche un potenziale anti-aterogeno, ripetutamente dimostrato in modelli sperimentali e anche desumibile da diversi studi nell’uomo^3-5. Uno studio recente ha anche rivelato un potenziale per gli acidi grassi omega-3 nel ridurre il rischio di rottura di placca in pazienti in attesa di un’endoarterectomia carotidea ⁶. In tale studio, placche di pazienti che prendevano olio di pesce sotto forma di capsule di preparazioni concentrate di acidi grassi omega-3 avevano una ridotta infiltrazione macrofagica e cappucci fibrosi più spessi rispetto a pazienti che assumevano capsule contenenti olio di girasole, una nota fonte di acidi grassi omega-6. Finora, tuttavia, gli omega-3 non sono stati mai messi in relazione con due fenomeni collegati al rischio di rottura di placca, cioè l’angiogenesi e la produzione di metalloproteinasi della matrice (matrix metalloproteinases, MMP). Studi di tal genere sono peraltro disponibili nella letteratura oncologica, da cui un buon numero di paradigmi sono attualmente sempre più trasferiti alla medicina cardiovascolare ⁷.
Nei primi anni ’90, Rose e Connolly trovarono che gli acidi grassi omega-3 assunti con la dieta inibivano la crescita e lo sviluppo di metastasi da cellule MDA-MB-435 di cancro mammario umano trapiantate nel topo nudo atimico, che ha un grave deficit immunitario soprattutto dell’immunità cellulo-mediata, e che dunque permette l’attecchimento di trapianti non singenici ⁸. Il potenziale invasivo di tali cellule, quando valutato in vitro, era ridotto dall’incubazione con acidi grassi eicosapentaenoico (EPA) e docosaesaenoico (DHA) ⁹. Gli stessi autori successivamente espansero tali risultati mostrando che gli effetti del DHA sulla crescita tumorale potevano essere spiegati da una riduzione dell’angiogenesi tumorale (conta dei microvasi) e della produzione di prostaglandina(PG)E2, un metabolita dell’acido arachidonico (AA) attraverso la via della cicloossigenasi (COX), a sua volta nota per la capacità d’influenzare la liberazione di MMP ¹⁰. In quello studio la liberazione di MMP non era misurata, ma usando il trapianto di simili cellule tumorali nel modello del topolino nudo, Suzuki et al. successivamente mostrarono che l’inibizione delle metastasi tumorali di una linea cellulare di cancro del colon da parte di EPA e DHA era associata con una ridotta attività di MMP-9 ¹¹. Una simile riduzione dell’attività di MMP-9 era anche trovata da Harris et al. nell’utero, nella placenta e nel fegato di ratti nutriti con una dieta arricchita di DHA ¹². A quel tempo gli autori spiegarono i loro risultati in base alla nota ipotesi “della competizione per il substrato”, secondo cui gli acidi grassi omega-3 competono con gli omega-6 (principalmente AA) come substrati per le COX. Tale competizione ridurrebbe la produzione di PGE2, che a sua volta si rifletterebbe nell’attività delle MMP. Un’attività anti-angiogenica diretta degli acidi grassi omega-3 veniva anche riportata in vitro da Kanayasu et al. ¹³, e da Tsujii et al. ¹⁴, su cellule endoteliali da arteria carotide bovina. Gli acidi grassi omega-3 potrebbero influenzare negativamente l’angiogenesi anche riducendo la produzione tumorale del fattore angiogenico vascular endothelial growth factor (VEGF) ¹⁵ e/o l’espressione endoteliale del recettore per il VEGF Flk-1 ¹⁶.

EFFETTI DEGLI ACIDI GRASSI OMEGA-3 SULL’ESPRESSIONE ENDOTELIALE DELLA COX-2

Prostaglandine e trombossani sono modulatori del tono vascolare e dell’emostasi sia in condizioni fisiologiche che patologiche. La produzione di questi eicosanoidi è regolata dalla disponibilità di aa e di altri acidi grassi precursori, e dall’attività delle PGH sintasi (PGHS), più comunemente designate come COX ¹⁷. La liberazione di AA dai fosfolipidi di membrana è mediata da fosfolipasi. Una volta liberato, l’AA è convertito a PGH2 tramite le COX. Le COX sono dunque gli enzimi limitanti di tale processo, e posseggono sia un’attività cicloossigenasica, che catalizza l’incorporazione di due molecole di ossigeno nell’AA per formare PGG2, che un’attività perossidasica, che catalizza una riduzione con due elettroni della PGG2 a PGH2. Una isomerizzazione o una riduzione della PGH2 producono prodotti terminali bioattivi, quali prostaciclina e trombossano ¹⁷. Si conoscono oggi due isoforme di COX, COX-1 e COX-2. Il gene della COX-1 è di 22kb ed è localizzato sul cromosoma ⁹. Il suo prodotto è una proteina di 69-kDa, espresso costitutivamente in molti tessuti, tra cui l’endotelio, i monociti, le piastrine, i dotti collettori del rene e le vescicole seminali ¹⁸. Recentemente è stata identificata una variante della COX-1, derivante da un taglio alternativo del gene di partenza, che è inibito selettivamente dall’acetaminofene, e denominato COX-3 ¹⁹. In contrasto con la COX-1, la COX-2 non è rinvenibile in molti tessuti in condizioni basali, ma la sua espressione può essere indotta rapidamente in risposta a stimoli infiammatori e mitogeni ¹⁷. Nell’endotelio vascolare, l’espressione di COX-2 è regolata da fattori di crescita ²⁰, lipopolisaccaride batterico ²¹ e citochine ²² attraverso vie di traduzione del segnale tradizionali e solo parzialmente specifiche per l’agente induttore. Per esempio, l’ IL-1b è stata dimostrata capace di indurre COX-2 attraverso un meccanismo mediato dall’attivazione delle extracellular signal-regulated kinases (ERKs), la c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase (JNK/SAPK), e la p38 mitogen-activated protein(MAP) kinase ²³. La lisofosfatidilcolina, che è una componente delle LDL ossidate, attiva l’espressione di COX-2 attraverso l’attivazione della p38 MAP kinasi e dei fattori di trascrizione cAMP-responsive element binding protein (CREB) e activating transcription factor(ATF)-1 ²⁴. Gli esteri del forbolo (phorbol-myristate acetate, PMA), noto attivatore della protein kinasi C (PKC), induce COX-2 primariamente attraverso l’attivazione di ERK1/2 ²⁵.
Il promotore del gene della COX-2 contiene sequenze responsive a fattori di trascrizione tradizionali, quali NF-kB, activator protein(AP)-2, NF-IL6 e CREB 18. Esiste tuttavia anche uno stretto controllo post-trascrizionale di COX-2 sull’estremità non tradotta 3’ del suo mRNA, a causa della presenza di copie multiple di elementi ricchi in adenine-uracile (AU) che regolano la stabilità dell’RNA messaggero e la sua traduzione in proteina ²⁶.
I ruoli specifici della COX-1 e della COX-2 vascolari, e il loro contributo alla fisiopatologia dell’aterosclerosi sono ancora in parte controversi. Studi hanno dimostrato che sia l’mRNA che la proteina per COX-2 sono presenti nelle placche aterosclerotiche, nei macrofagi e nelle cellule muscolari lisce, mentre sia COX-1 che COX-2 sono presenti nell’endotelio sia di vasi normali che con aterosclerosi ^27,28. Tuttavia diverse linee di evidenza indicano un ruolo cruciale della COX-2 nell’angiogenesi indotta da citochine ²⁹, attraverso effetti pro-angiogenici mediati da PG ^30,31. I meccanismi molecolari di questo fenomeno sono complessi e non ancora tutti chiariti. Sembra esserci tuttavia una stretta relazione tra l’attività di COX-2 e la liberazione di alcune MMP, poiché un’aumentata produzione di MMP attraverso vie dipendenti da PGE/cAMP è stata dimostrata in macrofagi ³² e, più recentemente, l’uso di inibitori selettivi di COX-2 è stato dimostrato inibire la liberazione di MMP-9 e di MMP-2 promossa dalla sovra-espressione di COX-2 in epatociti ³³. In lesioni aterosclerotiche ottenute da pazienti con malattia vascolare carotidea sintomatica sono state dimostrate la sovraespressione simultanea e funzionalmente coordinata di COX-2, PGE sintasi ed MMP ³⁴, e la co-localizzazione di COX-2. MMP-9 e della MMP di membrana tipo 1 nell’endotelio dei vasa vasorum in aorte aterosclerotiche umane ³⁵. Pertanto, un’aumentata espressione e un’aumentatata attività della COX-2 endoteliale in lesioni aterosclerotiche appare legata all’instabilità di placca direttamente attraverso la produzione e la liberazione di MMP, e indirettamente promuovendo l’angiogenesi di placca.
L’opportunità di inibire l’attività della COX-2 nell’aterosclerosi è stata studiata utilizzando modelli murini di aterosclerosi. I risultati sinora sono stati controversi: un trattamento con inibitori selettivi di COX-2 è stato riportato ridurre, aumentare o non avere alcun impatto sull’aterosclerosi ^36-40. Questi studi suggeriscono che il ruolo della COX-2 nell’aterosclerosi è complesso e può variare con lo stadio delle lesioni o con il modello animale. Una revisione critica del disegno sperimentale degli studi sinora pubblicati fornisce diverse spiegazioni plausibili per la variabilità dei risultati. Studi che hanno riportato un effetto benefico dell’inibizione selettiva della COX-2 nell’aterosclerosi hanno principalmente guardato agli effetti del trattamento sulla formazione di lesioni precoci, mentre studi che non hanno mostrato alcun effetto hanno principalmente valutato l’impatto su lesioni avanzate. Pertanto si può ipotizzare che il contributo della COX-2 nell’aterogenesi vari nel tempo secondo lo stadio delle lesioni.

L’effetto degli acidi grassi omega-3 sull’espressione e l’attività della COX-2 in tessuti vascolari non era stato sinora studiato estesamente. Nella linea di cellule monocitoidi murine RAW264.7, il DHA ^41,42, ma non l’EPA 43, ha ridotto l’espressione stimolata di COX-2. Sono stati pure disparati i risultati ottenuti su cellule endoteliali in coltura. Gilbert et al. hanno mostrato che il trattamento con DHA di cellule endoteliali aortiche bovine potenziava l’espressione di COX-2 indotta dal PMA ⁴⁴. Per converso, l’EPA, ma non il DHA, riduceva fortemente l’espressione di COX-2 indotta da IL-1b in cellule endoteliali umane microvascolari ⁴⁵.
Utilizzando cellule endoteliali sia da vena safena umana che da vena di cordone ombelicale, noi abbiamo di recente osservato che il trattamento con DHA prima della stimolazione con IL-1b riduce fortemente l’espressione e l’attività della COX-2, con un meccanismo che coinvolge la ridotta produzione e liberazione di specie reattive dell’ossigeno (Fig. 1) 1. Questo effetto sembra interpretabile sulla base di un’interferenza da parte del trattamento con DHA sull’assemblaggio del principale complesso enzimatico che genera anione superossido, l’NADPH ossidasi, sulla membrana plasmatica. Il complesso dell’NADPH ossidasi consiste di diverse subunità: due di esse, p22phox e l’omologa endoteliale gp91phox, sono proteine integrali di membrana. Al contrario, le subunità p47phox e p67phox sono localizzate nel citosol. Con l’attivazione, la p47phox viene fosforilata da una PKC e, in complesso con la p67phox, traslocata sulla membrana plasmatica, costituendo il complesso attivo ⁴⁶. Barbieri et al. hanno recentemente mostrato che l’attività della NADPH ossidasi è coinvolta nella regolazione dell’espressione della COX-2 ⁴⁷, e i nostri dati suggeriscono che il trattamento con DHA prima della stimolazione altera la composizione della membrana plasmatica e lo stato fisico della stessa, prevenendo in parte la traslocazione e l’attivazione della p47phox 1.

UNICITÀ DEGLI ACIDI GRASSI OMEGA-3 A CONFRONTO CON ALTRI FARMACI ANTI-INFIAMMATORI E ANTITROMBOTICI CHE INTERFERISCONO CON LE COX

Gli inibitori selettivi di COX-2 (coxibs), inizialmente sviluppati come farmaci anti-infiammatori con il potenziale di una minore tossicità gastrica per il fatto che essi risparmiano la produzione di prostaglandine gastro-protettive, sono di recente stati al centro di un forte dibattito nella letteratura medica per i loro effetti avversi cardiovascolari, e principalmente per un aumento d’incidenza di infarto miocardico e di morte, imputate ad una maggior incidenza di trombosi ^48-51. Questo è interpretato al meglio, al momento attuale, per l’effetto inibitorio che i coxib hanno sulla produzione vascolare di prostaciclina, produzione che, nelle condizioni di shear stress normalmente presenti sulla superficie vascolare interna, è principalmente dovuta alla COX-2 ⁵². D’altra parte gli acidi grassi omega-3, oramai usati ampiamente per decadi nella medicina cardiovascolare, appaiono estremamente sicuri ⁵³. Come possiamo dunque riconciliare la nozione che gli effetti inibitori degli acidi grassi omega-3 sulla COX-2 vascolare non sia potenzialmente dannosa? Dobbiamo evidenziare diverse differenze tra i farmaci anti-infiammatori non steroidei classici, i coxib, e gli acidi grassi omega-3 (Tabella I).

Anzitutto bisogna dire che, a differenza dei coxib, gli acidi grassi omega-3 interferiscono anche con la produzione piastrinica di TX, probabilmente perché l’EPA è un substrato peggiore dell’AA e il DHA è un vero falso substrato ^54-56. In aggiunta, qualsiasi TXA3 che derivi dalla metabolizzazione dell’EPA è praticamente inattivo come attivatore piastrinico ^54,55. Sebbene gli effetti degli acidi grassi omega-3 sulla produzione piastrinica di TX siano certamente di entità assai minore rispetto all’inibizione pressoché totale che avviene con aspirina, questi appaiono superiori, per tali aspetti, rispetto ai coxib, che lasciano virtualmente intatta la produzione piastrinica di trombossano.
In secondo luogo, gli effetti degli acidi grassi omega-3 sulla produzione di prostaciclina sono lontani dall’inibizione pressoché completa che avviene con i coxib, con l’aspirina ad alte dosi o con i farmaci anti-infiammatori non steroidei classici. Addirittura, la capacità di produzione di prostaciclina da frammenti vascolari ottenuti chirurgicamente da pazienti trattati cronicamente con acidi grassi omega-3 ha mostrato un aumento di produzione ⁵⁷, al contrario dell’inibizione osservata ripetutamente in sistemi colturali ⁵⁸.
In terzo luogo, gli acidi grassi omega-3 appaiono unici, tra i farmaci qui in discussione, per la loro capacità d’interferire anche con la produzione e/o l’attività dei leucotrieni ⁵⁹, recentemente emersi come importanti attori patogenetici nell’aterosclerosi, principalmente per le proprietà chemoattrattanti del leucotriene B4 4.
Infine, un’azione degli omega-3 su queste vie a livello dell’espressione genica piuttosto che dell’attività enzimatica, consente a queste sostanze di avere uno spettro d’azione molto più ampio dei supposti “proiettili magici” rappresentati da tutte le altre classi di farmaci qui discusse. E’ probabile che questo spostamento “moderato” nella produzione di mediatori, nelle vie intracellulari di traduzione del segnale e dell’espressione genica verso un fenotipo cellulare caratterizzato da una minore reattività nei confronti degli stimoli pro-infiammatori ambientali sia la migliore strategia “globale” oggi disponibile per combattere la malattia vascolare atero-trombotica.

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Focus Fig. 1

Focus – Tabella I